这些样本冻存和复苏的坑,怎么破?

2018-08-22 20:06:50 / 打印

多年的斗智斗勇,终于出坑了!

文/向日葵

小葵最初做实验的时候,往往看个大概就开始操作了,常常以为自己都会了,但经常掉坑里。想少走弯路,就要深谙其中门道,避开前人所遇到的陷阱。今天小葵就来讲讲自己亲身经历的那些不堪回首的过往,希望大家引以为戒。 

1

复苏时遇到冻存时挖的坑

实验室偶尔也会发生这样的情况:“靠,细胞要死了,赶紧冻掉,不能让细胞死在我手里。”“天呢,细胞培养液都这么黄了,赶紧冻掉。”“妈呀,细胞融合度都逼近100%了,赶紧冻掉。”“咦,细胞好像少了点,算了,就这样吧。”如果你复苏的细胞就是上面这些人所留下来的,那就要格外注意了。

解决方法:

所谓知己知彼才能百战不殆,在复苏前,一定要先清楚地了解这份细胞的增殖能力。如果增殖能力不高,接种时就要增加细胞接种密度并添加5%~10%的血清。如果细胞本身数量就非常少,也可以不离心,直接接种培养(加入培养基的体积>5倍的冻存细胞体积)。复苏后3天内尽量少对细胞进行操作,延迟换液时间。

2

无孔不入的微生物

做实验就像走钢丝,稍不留神就会跌进充满微生物的沼泽中不能自拔。

解决办法:

冻存时,一定要拧紧冻存管的盖子,否则水浴复苏的时候,水浴锅中的水就会渗入到冻存管中去,造成细胞的污染并会使那些低免疫力的接受移植的患者产生严重的感染。

推荐几款最新的细胞干式复苏的仪器给大家,可以避免传统人工水浴方法的污染风险并且在复苏的整个过程中可对数据进行追踪。

适用于冻存袋

适用于冻存管

3

细胞非正常“复苏”

那是一个安静的下午,大家都在专心地做着实验,突然听到有人大叫“这是谁的细胞,一直放在外面,都化了。”原来刚才同事取细胞的时候,把整个冻存架都拿了出来,后来居然忘记再把它放回液氮罐中。而此时细胞们已经无一幸免地 “融化了”。

解决办法:

马上种瓶,千万不要把这些细胞继续放回液氮罐中冻存。此时细胞内已经有大量的冰晶形成,细胞膜已经受到损伤,如果离心就会造成细胞膜完全破碎、细胞立即死亡的后果。所以切记不要离心,而应直接种瓶,也不要进行吹打,只轻轻摇晃。培养时加入10%的血清,种瓶后48h内都不要对细胞进行操作。这是一个真实的案例,后来在大家的努力下,那些增殖能力本来就旺盛的细胞还是活了下来。

备注:本办法也同样适用于那些停电后造成超低温冰箱升温(一般升温到-40℃时就要小心了)的情况。

4

拿错了细胞,养了别人家的“孩子”

电视剧里抱错孩子的狗血剧情也同样会发生在实验室中。学校的液氮罐基本上都是公用的,所以如果样本标记不详就会发生拿错的情况。

解决办法:

每支冻存管上都应用冻存专用的记号笔详细标记上细胞名称、冻存时间、样本批号等信息并将这些信息详细记录在册。存放细胞时,最好规定每个人的存放位置,免得下次找细胞的时候非要把整个液氮罐翻个底朝天才找得到。复苏拿取细胞时,也应在对应的存放位置处进行查找,找到对应的细胞后应核查记录册上的信息是否与冻存管上的细胞名称、冻存时间、样本批号一致。

5

安全第一,细胞第二

凡是和液氮接触的操作,都应该注意安全。小编的同事Z就在一次打开液氮罐盖子的时候被气体冲击了眼睛,导致眼睛当场流血,不过后来经过医治已经没有什么大碍了。还有小编的同事L在前单位工作时有一次在样本保存室里突然晕倒了(估计是液氮罐漏气所致)。

解决办法:

操作人员在接触液氮罐时应戴防护面罩、防护手套,穿防护衣,防止冻存管或气体爆裂对人体造成伤害。在存放液氮罐的房间中也应装有检测气体浓度的报警装置,防止人员晕厥的现象发生。大家在做实验的时候一定要小心操作、注意安全。

6

如何让冻存的组织满血复活

很多时候我们都会遇到组织复苏培养的成功率低、长势慢的情况,这到底是哪里出错了呢?

解决办法:

(1)组织要剪得足够小;

(2)程序降温盒不要立马放入-80℃冰箱中,应先置于4℃冰箱内15min~30min;

(3)冻存液的体积应至少是组织体积的2~3倍;

(4)组织复苏后进行培养时,应在培养基中加入5%~10%的血清。

7

复苏后,细胞不见起色就扔掉?!

复苏2~3天后,认为细胞没有明显增殖就扔掉细胞,但其实有些细胞需要复苏一周后才会发生明显的变化。

解决办法:

如果复苏培养3天后细胞仍不见增殖,先不要着急换液。试着补加血清、细胞因子,等一周后再看细胞增殖情况再定。

8

心急冻不了好细胞

冻存时,不要将细胞放入刚刚从-80℃冰箱中取出的程序降温盒内(此时盒内的异丙醇还是冻住的)。这样会导致细胞在一开始的时候就进入低温状态,影响细胞复苏后的存活率。

解决办法:

将程序降温盒提前拿至室温中,使细胞可以从室温降至-80℃。

常规的程序降温盒中是填充了异丙醇的,所以能够以每分钟一度的速度进行降温。但是异丙醇属于有毒溶剂,又容易挥发,长期使用不但会对环境造成污染也对实验人员的安全有不利影响。推荐一款新的细胞程序降温盒,不需要填充异丙醇就可以正常工作,而且很容易打开盖子,方便拿取。

新型程序降温盒

其他注意细节:

1、刚刚复苏的细胞就像刚刚出生的小BABY一样脆弱。一切接触细胞的动作都要尽可能地轻柔。

2、低速离心,离心力不超过300g。

3、除了极少数细胞对DMSO过敏外,大部分的细胞都不需要去除DMSO。细胞复苏后可直接接种,第二天进行换液即可。

4、配置好的冻存液在4℃冰箱内可以暂存1周,在-20℃冰箱内可以保存一个月。不过最好还是现配现用、不要反复冻融。

5、 DMSO存在一定的毒性,配置冻存液时一定要戴好手套。

6、 复苏时使用的培养基最好与冻存前使用的培养基一致。

7、 取冻存盒的时候一定要谨防冻伤,不要把你的小鲜肉“粘”到冻存盒上面。

8、复苏第二天看一下细胞,如果细胞状态不行可以补加一下血清、因子。

附:

表1生物样本及样本提取物常用保存方式比较

图片来源于eBiobank

表2.生物标本的特定生物标志物稳定性与贮存温度/持续时间的关系

(稳定性符号为:M,多个结果;N,不稳定;S,稳定。)

图片来源于eBiobank

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