原代细胞的分离方法

2018-12-11 12:15:20 / 打印

细胞培养可以分为原代培养和传代培养。直接从生物体内获得细胞进行首次培养称为原代培养。当培养的细胞增殖到一定密度后,则需要再转移扩大培养称为传代培养。原代培养是获得细胞,建立各种细胞系的第一步,是从事细胞培养工作的晟基本技术,原代培养方法很多,最基本的有两种,组织块培养和单层细胞培养。

组织块培养是最为常用的、简便易行的且成功率较高的原代培养方法,把组织切割成0.5~1mm3的小块后,在不加任何黏附剂的情况下,它们也能直接贴附于瓶壁上,然后细胞自组织块边缘向外长出生长晕,最后细胞连接成片,形成单层培养细胞。此方法程序比较简单,所以是当前原代细胞培养常用的方法。单层细胞培养主要是把剪碎的组织块通过酶消化的方式使组织块松散,然后用吸管反复吹打,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态,静置后让未被消化完的组织自然下沉,然后将上层的细胞悬液移入无菌离心管中,调整细胞密度接种培养。

原代细胞培养取材的基本要求:取材要注意新鲜和保鲜,应严格无菌,防止机械损伤,尽量去除无用组织和避免干燥,应注意组织类型、分化程度和年龄等,并做好相应记录。取材的各类组织包括:皮肤、黏膜、内脏、实体瘤、血液细胞、骨髓、羊水、胸/腹水细胞、动物组织和胚体组织等。实体组织材料由于细胞问结合紧密,为了使组织中的细胞充分分散,形成细胞悬液,常采用机械分散法和消化分离法来分散细胞。机械分散法属物理分离方法,特点是简便、快速,但对组织机械损伤大,细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。而消化分离法是先把组织剪成小块,应用酶的生化作用和非酶的化学作用(例如EDTA)进一步使细胞间结构松动,再结合机械方法,用吸管吹打或振荡,使细胞团充分分散,这样接种培养后,细胞容易贴壁生长。消化分离法需要注意的是:①组织块必须漂洗2~3次咀除去组织中的钙、镁离子以及血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用;②胰蛋白酶浓度不宜过高,作用时间不能太长,以免产生毒性作用;⑧消化后组织不仅要尽量弃去消化液,以免毒性产生,而且动作要轻,以免膨松的细胞随漂洗而丢失。

我们咀新生大鼠心肌细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分离培养为例,介绍原代细胞培养步骤及注意事项。

一、悬浮细胞的分离方法

1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。

2、去掉上清,离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。

3、用培养基重悬,调整适当细胞浓度后分瓶培养。

4、如选用悬液中某种细胞,可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

二、实体组织材料的分离方法

(一)机械分散法

1、纤维成分很少的脑组织,部分胚胎组织,用剪刀剪碎至1mm3的组织块。

2、用PBS清洗两次后

①用吸管吹打,分散组织细胞。

②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出。

③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。

3、收集细胞转入离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。

4、去上清,加入含血清的培养基,重悬后移至培养瓶中培养。

(二)消化分离法

1、酶消化分离法(过夜冷消化法)

①细胞间质较少的软组织,如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等,用Hanks液清洗组织三次,剪成碎块大小为4毫米左右。

②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。

③加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过夜。

④次日再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2-3次。

⑤加入少量含血清的培养基吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。

2、非酶消化法(EDTA消化法)

①把组织块剪碎,呈1mm3大小的组织块。

②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。

③加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。

④弃去上清,加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应,并洗涤2-3次后,加入完全培养基。

⑤用吸管吹打,使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。

(三)原代细胞培养

原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段,同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如,用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养,然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选,根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案,有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。

(四)原代细胞的传代、保存

(1)传代:依椐细胞的生长状态,生长的细胞1:2或1:3进行传代。

(2)保存:DMSO+培养液+血清

按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃  过夜)→液氮。

(五)原代细胞的复苏

(1)取出细胞,迅速放入37℃温水中快速解冻。

(2)吸出细胞悬液,并加10倍以上培养液。

(3)用培养液适当稀释后接种培养瓶,放入37℃ CO2 培养箱静置培养。

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