HBsAg假阳性和假阴性原因分析之ELISA法和金标法

2018-09-11 10:57:38 / 打印
ELISA法

ELISA法假阴性原因

1、标本用肝素或EDTA等抗凝处理易造成HBsAg检测结果假阴性,肝素抗凝血浆会增加OD值,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷,能吸附酶标记物不易洗脱有关;EDTA、酶抑制剂可抑制ELISA系统中的辣根过氧化物酶活性,造成假阴性。

2、标本保存不当,在冰箱内保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体。标本放置时间延长(如一天以上),有时抗原或抗体免疫活性减弱,便出现假阴性。因此若采血后不能及时检测,5天内检测标本分离血清置于4℃冰箱内;超过5天不能检测的,应放在-20℃低温冰箱中。

3、低浓度HBsAg标本(弱阳性HBsAg)易受加样时间(特别是大批量标本)、试剂平衡时间、溶血程度的影响,出现假阴性。如加样时间在30分钟内的差异是最大的。

4、高浓度HBsAg在ELISA一步法检测中易出现假阴性,即HBsAg的钩状效应。从原理来讲,一步法中HBsAg与包被板上的HBsAb及酶结合的HBsAb结合是双向的,当HBsAg浓度过高时,HBsAg与包被板上的抗体及酶结合物中的抗体均是单向结合,不能形成抗体-抗原-抗体酶复合物,使酶标记抗体在随后的洗板中洗掉,从而显出阴性结果。但是在ELISA两步法中,高浓度的HBsAg只能与包被的HBsAb“饱和”地结合,多余部分被洗掉,随后加入的酶结合的HBsAb正好通过HBsAg的“桥梁”作用而结合在酶标板上,显示阳性结果。因此当HBsAg强浓度时用ELISA一步法检测存在假阴性现象。解决此问题的最好办法有:对标本进行稀释;不单检测HBsAg;采用ELISA两步法检测可消除漏检现象。

5、由于慢性病毒携带者(低水平HBsAg携带者)或HBV感染的潜伏期,HBsAg浓度低于检测水平的下限,由此造成假阴性。

6、S基因突变导致HBsAg的氨基酸结构改变,由于多数商用试剂盒检测系统采用的为多克隆抗体检测HBsAg的a决定簇,这一区域的点突变即可导致临界观测值或阴性结果,造成假阴性。

7、药物的影响:高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物,影响HBsAg的检出,所以一些HBsAg阳性的患者注射高效价乙肝免疫球蛋白后,HBsAg检测呈假阴性反应。用0.5M的盐酸处理标本1小时可提高HBsAg的检出率。

ELISA法假阳性原因

1、溶血或红细胞:有国内报道酶免HBsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性,因红细胞破坏溶解时释放出大量血红蛋白,血红蛋白的亚铁血红素具有弱过氧化物酶活性,其作用效应与辣根过氧化物酶(HRP)类似,能与预包被抗体(Ab)结合,一步法洗脱步骤往往难以完全洗脱,残留的过氧化物酶催化底物四甲基联苯胺(TMB)产生假阳性。因此在采集血标本时,量不能太少,操作过程中如果血清混浊,一定要离心后再吸样,避免红细胞加入造成假阳性。对于溶血的标本最好重新采集血液,进行重新检测。

2、标本凝集不全或标本离心处理时采用不同的离心转速和离心时间,也可造成假阳性结果。若在血液还未开始凝固时即强行分离血清,此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;离心转速过低或离心时间过短,由于血液离心不充分均可导致假阳性。解决的办法最好是血液标本采集后放水浴箱,使其充分凝固再用3000rpm,离心15分钟再分离血清。

3、干扰物质的影响:如类风湿因子(RF)、补体、AFP等可以造成HBsAg检测结果假阳性。RF因子可与标记二抗的Fc段结合造成假阳性;补体从C1q活化,使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构,Fc的C1q分子结合点暴露出来,则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性,采用56℃ 30分钟灭活补体可降低假阳性率;高浓度的AFP(如孕妇),在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深造成假阳性结果。

4、某些细菌污染标本(如表皮球菌等),菌体中可能含有内源性HRP,造成检测结果假阳性。

金标法

金标法假阴性原因

1、检测时间短,金标法最适判读时间为15~30分钟,若时间太短就会发生一些弱阳性HBsAg标本出现假阴性。

2、灵敏度较低,金标法>1ng/ml,而ELISA法<1ng/ml也能检出。

3、层析过快,HBsAg-Ab1-Au还没来得及与Ab2结合就越过了检测线,这就可能造成假阴性结果。

4、后带现象,即HBsAg的钩状效应。不管是ELISA法还是金标法,因反应原理均为“一步法”,所以当标本中HBsAg强阳性时两者均可出现后带现象,检验结果反而出现假阴性。

5、个别标本可能存在HBsAg亚型差异而不易检出。

金标法假阳性原因

1、溶血或红细胞的标本,有时会在检测区出现一条颜色很浅的非特异型层析线,由于金标法主要是通过目视法判定结果,所以常会误认为假阳性,应该引起重视。

2、为预防乙肝,部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗的1~2周内,血清中有时可检出HBsAg弱阳性,形成一过性HBsAg阳性,这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg。建议接种乙肝疫苗后1个月内不应做HBsAg检测。笔者曾多次发现此类因为注射乙肝疫苗出现的假阳性问题,但用ELISA一步法检测仍为阴性即可消除上述干扰,其机理尚未十分清楚。

3、汉坦病毒会造成HBsAg金标法检测假阳性,可能是汉坦病毒与HBsAg存在交叉性,易造成假阳性结果。

来源:检验视界网

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