动植物细胞培养室怎么建设 ?

2018-11-19 21:00:15 / 打印

  细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作,避免微生物及其他有害因素的影响。目前,超净工作台的广泛使用,很大程度上方便了组织细胞培养工作,并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 

细胞培养实验室应能进行六方面的工作:无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 

    因此,无论是动物细胞培养室还是植物细胞培养实验室,必定有一下几种房间。 

①洗涤间:根据工作量的大小决定其大小。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽,用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置水槽,用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大,可以购置一台洗瓶机。准备洗液缸,专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。 

②培养基配制间:配备的主要仪器设备有:冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。 

③消毒间:配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。 灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅,较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。如果没有条件的话,可以将上述工作间合并成一个准备间,要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风,地面要便于清洁、防滑。 

④无菌操作室:无菌操作室主要用于实验材料的接种操作,所以又叫接种室。通常由里外两间组成,外间是缓冲间,用于准备工作,还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开,两个门也不要同时开启,以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修,工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台,紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。 

⑤培养室。 

    在实验室内,还会有以下常用的基本设备。 

Ⅰ. 仪器: 

(1)显微镜:倒置显微镜——是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一,便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。 

(2)培养箱:体外培养的细胞和体内细胞一样,需要在恒定的温度下生存,大多数情况下,最适温度是37℃,温差变化一般不应超过±0.5℃,细胞在温度升高2℃时,持续数小时即不能耐受,40℃以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱,如具有较高灵敏度的恒温培养箱及CO2培养箱。 

(3)干燥箱:用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用,玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时,电热干燥箱升温较高,一般需达到160℃以上。通常使用鼓风式电热干燥箱。其优点是温度均匀、效果较好,缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风而应鼓风与升温同时开始,至100℃时,停止鼓风,应避免包裹器皿的纸或棉花烧焦,烧焦的碎屑可影响细胞的生长。消毒后,不能立即打开箱门以免骤冷而导致玻璃器皿损坏,应等候温度自然下降至100℃以下方可开门。 

(4)水纯化装置:细胞培养对水的质量要求较高,细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。水纯化时可采用离子交换装置或蒸馏器。离子交换纯水尚不能有效去除有机物,因此用水时尚需再次蒸馏。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水:即使是用于玻璃器皿的冲洗,也应使用二次以上蒸馏水。 

(5)冰箱:细胞培养室必须配备。

a.普通冰箱或冷藏柜 

——储存培养液、生理盐水、Hank’s液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本。 

b.低温冰箱(-20℃)、超低温冰箱 

——用于储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂,如酶、血清等。 

——细胞培养室的冰箱应属专用,不得存放易挥发、易燃烧等对细胞有害的物质,且应保持清洁。 

(6)细胞冷冻储存器:储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小,取放使用方便及液氮挥发量(经济)三种因素。液氮容器的大小可自25L~500L,可以储存1ml的安瓿250~15000个左右。液氮温度可低达-196℃,使用时应防止冻伤。由于液氮不断挥发,应注意观察存留液氮情况,及时定期补充液氮,避免挥发过多而致细胞受损。 

(7)离心机:进行细胞培养时,常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作,通常需要使用离心机。 

a.一般可常规配置4000rpm的国产台式离心机,例如细胞沉降,使用80~100g的离心机即可,离心力过大有时可能引起细胞的损伤。 

b.另外,可根据需要添置其他类型如大容量或可调节温度的离心机等。 

c.若需特殊用途,例如某些细胞的分离制备需梯度离心,则需另行配置实验所需的具备其他特殊功能的离心机。 

(8)天平:常用的有扭力天平、精密天平及各种电子天平。 

分析天平的感量为0.1mg、0.01mg和0.001mg。根据称取物质的量和称量精度的要求,选择适宜级别的天平。要求精密称定时,当取样量大于100mg选用感量为0.1mg天平,在100-10mg选用感量为0.01mg天平,小于10mg选用感量为0.001mg天平。 

(9)消毒器:直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。 

(10)滤器:目前细胞培养工作中采用的培养用液,包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质,这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能,因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。 

Ⅱ. 培养用器皿: 

(1)培养器皿:供细胞接种、生长等用的器皿,可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。 

(a)玻璃培养器皿的优点是多数细胞均可生长,易于清洗、消毒,可反复使用,并且透明而便于观察;缺点是易碎,清洗时费人力。 

(b)塑料制培养器皿的优点是一次性使用,厂家已消毒灭菌密封包装,打开即可用于细胞培养操作。 

常用的培养器皿: 

培养瓶:由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞,胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量(ml)表示,如250ml、100ml、25ml等;进口培养瓶则多以底面积(cm2)表示。 

培养皿:由玻璃或塑料制成,供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。 

多孔培养板:为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂,可同时测试大量样本,易于进行无菌操作。培养板分为各种规格,常用的规格有:96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。 

各种单层生长的细胞在培养器皿中长满时可获得的细胞数,主要是取决于器皿的底表面积和细胞体积的大小。常用培养器皿及可获得的细胞数(以Hela细胞为例)。 

(2)培养操作有关的器皿: 

a.贮液瓶:主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格,如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。 

b.吸管:主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体,常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管,除可以作吸取、转移液体外,弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。 

c.加样器(移液器):用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小,吸量准确、方便。尤以微量加样器,可保证实验样品(或试剂)含量精确,重复性良好。目前,可高温消毒的,多通道的各类移液器可供使用者选择,能确保加样准确、快速、方便并且达到无菌要求。 

(3)其他用品:尚有收集细胞用的离心管,放置试剂或临时插置吸管用的试管,装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器,用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒或贮槽,套于吸管顶部的橡胶吸头,封闭各种瓶、管的胶塞、盖子、冻存细胞用的安瓿或冻存管、不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗,超净工作台使用的酒精灯,供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。 

Ⅲ.器械:主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。 (1)常用的有:手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪(弯剪及直剪),用于解剖动物、分离及切剪组织,制备原代培养的材料;眼科虹膜小剪(弯剪或直剪),用于将组织材料剪成小块;血管钳及组织镊、眼科镊(弯、直),用于持取无菌物品(如小盖玻片)夹持组织等;口腔科探针或代用品,用以放置原代培养之组织小块。 

(2)特殊设备:细胞培养实验室除了应配备上述的常用基本设备以外,如有条件,可添置一些特殊或先进的设备仪器,以便更有效、更精确、更深入地进行实验室工作。 

例如:  

①酶联免疫检测仪——可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等。 ②超低温冰箱(-85℃)——便于储存某些试剂及标本。 

③旋转培养器——用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养。 ④荧光显微镜——进行荧光染色样本的观察。 ⑤流式细胞仪——可更精确及快速检测细胞。 ⑥用于检测细胞培养条件的各种仪器,例如专门为快速分析细胞培养基中主要或关键营养成分、代谢产物及气体含量设计的多功能细胞培养分析仪、手提式CO2浓度测定仪等。 

一、植物细胞培养实验室 

    除了上面那些基本的设备以外,对于植物细胞培养实验室来说,为了控制培养室的温度和光照时间及其强度,培养室的房间不要窗户,但应当留一个通气窗,并安上排气扇。室内温度由空调控制,光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修,地面用水磨石或瓷砖铺设,一般要分两间,一为光照培养室,一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。  

    而且,培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W,固定在培养架的侧面或搁板的下面,每层有两支日光灯,距离在20cm,光照强度为2000-3000lx。 

    当然,植物培养需要辅助实验室,因此还需要鉴定室和温室。 鉴定室包括细胞学鉴定室和生化分析室。 

    细胞学鉴定室是为了对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥,使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。 

    在以培养细胞产物为主要目的的实验室中,应建立相应的分析化验实验室,以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。仪器包括离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等。 

    温室是用于试管苗的锻炼和移植,为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。  

常用设备有:温室、弥雾装置、荫棚、移栽床、钵、盆、基质等。 

二、动物细胞培养室 

    对于动物细胞培养室来说,要保持无菌条件,因此要设置净化工作室,风淋室,传递窗,高效过滤器,洁净层流罩,生物安全柜,超净工作台,其中还要包括紫外灯,电热干燥箱,滤器,高压灭菌器。为了避免培养时出现细菌,会适当在培养液中添加抗生素,因此在培养室内要有抗生素。 

    为了满足动物细胞生长所需的条件,在培养室里也要设置纯水蒸馏器,纯水仪,培养板,培养瓶, CO2培养箱,培养基,血清。培养基是要根据培养的组织或细胞的类型不同而配制不同的培养基,配制时一定要加血清,而血清可以选用小牛血清。 

    检测细胞的仪器设备有倒置显微镜,酶标仪 ,微孔板震荡器,高速离心机,移液器,保存细胞的仪器设备是液氮罐。 

    细胞培养实验室还要包括实验室、准备间、缓冲间、培养室。 其中,实验室的要求有以下几点: 

①和缓冲间相连,缓冲间内备消毒服装和鞋,口罩等,入内换上; 

②设置1—2台超净工作台; 

③室内空气不流通,有适当的光线,清洁,干燥; 

④侧部可设传递窗,用于物品传递; 

⑤照明用荧光灯为好,消毒用紫外线灯; 

⑥在室内工作时,动作应轻微。 

    对于准备间,里面要求有大、小水槽,消毒设备,消毒后的物品和器械保藏柜,烘箱,蒸馏器(包括双蒸,三重蒸馏水),玻璃器皿,培养液,电炉等。 

所以,我们可以理解为缓冲间就是上面最基本实验室设备中的消毒间,准备间就是消毒间和培养基配制间,而实验室就是无菌操作室。 

三、社会价值 

    细胞培养实验室的社会价值在于,为实验提供基础,促进细胞培养的发展,细胞培养的好处如下: 

1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究。 

2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 

3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 

4.便于使用各种技术:相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 

5.是分子生物学和基因工程学的研究对象,也是其主要的组成部分。 

6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 

7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。  

8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。

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