细胞工程-细胞冻存与复苏

2018-11-19 05:17:41 / 打印

一、实验目的

掌握细胞冷冻保存的方法,能独立地进行细胞冻存与复苏操作。

二、实验原理

在传代培养早期把一部分细胞冻存备用是细胞培养的一个重要环节。通过冷冻手段保存起来,既可保持培养细胞的生物学特性和活力,又可对某个实验进行重复。u冻存对细胞的损害主要是低温条件下活细胞内外冰结晶造成机械损伤以及随着细胞外冰晶增多导致细胞出现脱水现象和盐类浓度上升时对细胞造成损伤。特别是在-5~-10℃之间,冰晶形成使电解质浓度增高,可造成细胞膜破裂、细胞器肿胀、微丝与微管解聚,使细胞受到巨大损伤,甚至死亡。克服这些损伤的有效方法是在培养液中添加保护物质并严格控制冻存条件(包括冻结速度和温度)。

常用的细胞冻存保护剂是二甲基亚砜(DMSO)和甘油。这些保护剂可使细胞内水的冰点下降,减少水分子形成冰晶;在缓慢的冻结条件下,能增大细胞膜对水的通透性,使细胞内水分在冻结前析出细胞外,促进细胞外冰冻造成的脱水效果;能降低电解质浓度,把低温下增加的电解质浓度造成的损伤减少到细胞能够耐受的程度;同时,能保护酶和蛋白质等。因此,在培养液中加入DMSO或甘油等冻存保护剂十分必要。特别是DMSO亲水性强,对二倍体细胞的毒性比甘油小及易于通过细胞膜而具有较好的保护效果。

细胞冻存一般都采用缓慢冷冻的方法,这可以保持细胞最大存活率。目前最广泛应用的冷冻剂是液氮,其沸点是-196℃,对细胞的酸碱度没有影响,气化时不残留沉淀。冻存细胞的复苏必须快速进行,即把冻存细胞快速融化,使之迅速度过细胞最易受损伤的温域(-5~0℃),以防止小冰晶转变为大冰晶而造成对细胞的损伤。

三、实验用品

1.器材

液氮罐,-80℃超低温冰箱,微量加样器,水浴锅,离心机,冻存管,离心管,细胞培养用材料,75%酒精棉球等。

2.试剂

培养基(DMEM),胎牛血清,0.25%胰蛋白酶溶液,二甲基亚砜(DMSO),液氮。

3.材料

Hela 细胞

四、实验步骤

1. 细胞冻存

(1) 取待冻存的细胞,弃废液,用0.25%胰酶在37℃下(放在二氧化碳培养箱中)消化2min后,加入等体积的新鲜培养基中止消化,并用枪将培养皿底部的细胞冲洗下来,转入15 mL离心管中。800 r·min

-1

离心4 min后,弃上清(尽量吸干净!),收集细胞沉淀。

(2) 加入1mL冻存液(10% DMSO+90% 含血清的DMEM培养基),吹打细胞均匀(切记:避免吹打出气泡!吹打时枪头不要离开液面!),制成细胞悬液。细胞浓度宜大,3×10

6

个/mL左右,并可适量增加小牛血清浓度至20%。

(3) 将细胞悬液转入2 mL冻存管中。用封口膜封裹,做好标记(写上姓名、细胞种类、时间及冻存条件等)。

(4) 冻存管先转入4℃冰箱30min,再转入-20℃ 冰箱2h,再放入- 80℃超低温冰箱保存过夜,次日转移到液氮中保存。

2. 细胞复苏

(1)从-80℃超低温冰箱中取出冻存管立即握在手中或37℃培养箱中进行快速解冻,直至管中培养液融化。

(2)再将冻存管放入50 mL离心管中,800r·min

-1

离心4 min后在超净工作台中用75%酒精棉球清洁管口,再打开,吸净上清,保留细胞沉淀。

(3)再加入1.5mL新鲜培养基,吹打均匀后(切记:避免吹打出气泡!),转入无菌培养皿中,置于37℃二氧化碳培养箱中培养2天。

(4) 隔日观察细胞生长情况,如果死细胞较多,复苏次日应换液。待细胞长满后可进行传代培养,并拍照记录结果。

五、注意事项

1.在使用含有DMSO的冻存液时,因为DMSO在室温状态易损伤细胞,所以在细胞加入冻存液后尽快放入4℃环境中。

2.严格按照无菌操作技术开展实验,避免交叉操作。

3.准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者的姓名。

六、实验报告

细胞的冻存与复苏

要求:要有细胞冻存前和复苏后的细胞照片!

七.思考题

1.应如何运用“缓慢冻存,快速复苏”的原理保存细胞?

2.冻存液的作用是什么?

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